Inmovilización de α

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12708 (2023) Citar este artículo

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En este estudio, la producción de isomaltooligosacárido a partir de almidón de cáscara de patata se llevó a cabo en tres pasos: licuefacción, sacarificación y transglucosilación. Además, se clonó el gen de la α-transglucosidasa de Aspergillus niger (familia GH31), transformándolo en E. coli BL21 (DE3), sobreexpresando y purificando la proteína resultante para la producción de α-transglucosidasa. Luego, la α-transglucosidasa generada se unió con nanopartículas magnéticas, lo que mejoró la reutilización hasta 5 ciclos con más del 60 % de actividad. Todas las modificaciones se caracterizaron utilizando los siguientes métodos: análisis infrarrojo por transformada de Fourier, microscopía electrónica de transmisión, microscopía electrónica de barrido de emisión de campo, espectroscopia de rayos X de dispersión de energía, espectroscopia de difracción de rayos X, análisis termogravimétrico y dispersión dinámica de luz (DLS). análisis. Además, RSM determinó las condiciones óptimas para la transglucosilación de la siguiente manera: relación enzima-sustrato 6,9 U g-1, tiempo de reacción 9 h, temperatura 45 °C y pH 5,5 con un rendimiento de 70 gl-1 (± 2,1 ). El análisis MALDI-TOF-MS mostró el DP de los IMO en rangos de 2 a 10. La caracterización estructural detallada del isomaltooligosacárido por GC-MS y NMR sugirió los residuos α-(1 → 4) y α-(1 → 6)-D-Glcp como constituyentes principales junto con los residuos α-(1 → 2) y α- (1 → 3) -Residuos de D-Glcp.

Los isomaltooligosacáridos (IMO) son oligosacáridos no digeribles pero fermentables que aumentan el crecimiento de ciertas bacterias beneficiosas para la salud, en particular bifidobacterias y lactobacilos, que influyen en el metabolismo intestinal y tienen un impacto en la ecología microbiana gastrointestinal1,2,3,4,5,6. Los IMO son oligosacáridos prebióticos compuestos por unidades de glucosa unidas principalmente por enlaces glicosídicos α-(1 → 6) y α-(1 → 4) con una menor proporción de α-(1 → 3) (nigerosa) y α-(1 → 2 ) (kojibiosa) enlace glicosídico7,8,9. Normalmente, los IMO tienen diferentes grados de polimerización (DP), que incluyen isomaltosa (DP2), isomaltotriosa (DP3), isopanosa, panosa (DP3), isomaltotetrosa (DP4) e isomaltopentosa (DP5)10,11. Los IMO no son digeridos por enzimas humanas sino fermentados por la flora intestinal que ejerce su efecto prebiótico5,12,13. Además del efecto prebiótico, los IMO tienen un índice glucémico bajo y actúan como un edulcorante bajo en calorías que brinda beneficios para la salud de las personas diabéticas10,14.

Comercialmente, los IMO se producen a partir de almidón extraído de diversas fuentes (camote, papa, tapioca, arroz y plátano)11,15,16,17,18. Generalmente, el método tradicional empleado para la producción de IMO constaba de tres pasos: licuefacción, sacarificación y transglucosilación6,19. Estudios recientes han demostrado la sacarificación y transglucosilación (SST) simultáneas para la producción de IMO16,20. Estos estudios mejoraron la eficiencia de la producción de IMO y redujeron el tiempo de reacción. Diferentes estudios también han informado sobre la producción enzimática de IMO a partir de sacarosa utilizando dextransucrasa y dextranasa21,22,23. Además, se informó que el desarrollo de nanopartículas magnéticas (MNP) basada en la inmovilización de la α-transglucosidasa es una mejor manera de mejorar la reutilización de la enzima24,25,26.

En este estudio, primero se llevó a cabo la extracción del almidón de la cáscara de papa y luego la licuefacción y sacarificación del almidón licuado. GenScript (Singapur) sintetizó un gen que codifica la α-transglucosidasa (PM promedio ~ 110 kDa) de Aspergillus niger (familia GH31) y lo clonó en el vector pET28a. Dada la importancia de las enzimas para la producción de IMO, se hizo un esfuerzo para expresarlas de forma heteróloga en E. coli BL21(DE3). Además, RSM optimizó la reacción de transglucosilación para maximizar el rendimiento de IMO. Posteriormente, la α-transglucosidasa producida se inmovilizó con MNP y se caracterizó mediante diversas técnicas analíticas. Finalmente, las características estructurales de la fracción de IMO purificada se analizaron utilizando MALDI-TOF-MS, GC-MS y NMR.

Los desechos de cáscara de papa se recogieron del comedor del instituto (NABI Mohali, Punjab, India) y se utilizaron para la extracción de almidón. Sigma-Aldrich adquirió todos los productos químicos utilizados en la caracterización de IMO y dos enzimas, Termamyl® SC DS (A4862) y Fungamyl® (A8220), utilizadas para la reacción de licuefacción y sacarificación. La secuencia del gen α-transglucosidasa de Aspergillus niger (familia GH31) fue sintetizada y clonada en el vector pET28a por GenScript Biotech Corporation. Los estándares de glucosa, maltosa, maltotriosa, isomaltosa, isomaltotriosa, panosa, isopanosa y todos los demás productos químicos utilizados en el presente estudio también se adquirieron de Sigma-Aldrich.

Primero se lavaron cáscaras de papa (100 g) y luego se mezclaron usando una licuadora a escala de laboratorio. Inmediatamente, la mezcla se filtró y el residuo restante se enjuagó con agua desionizada (5 x 200 ml) de 2 a 3 veces. El filtrado se recogió en un vaso de precipitados y se mantuvo a 4ºC para que se sedimentara el almidón. Se descartó el sobrenadante y la capa blanca de almidón se recogió del vaso de precipitados en una bandeja de horno y se dejó secar en un secador de aire caliente a 37 °C durante 24 h. Después de esto, los residuos secos se molieron en polvo fino y se almacenaron en un recipiente hermético para su uso posterior27,28.

Se añadió almidón extraído a agua y se formó una suspensión (1 g, 10 ml-1). El pH de la suspensión se fijó en 6,9 con ácido láctico. Se utilizaron diferentes proporciones de una enzima (Termamyl® SC DS) a un sustrato (almidón), como 0,3 a 5,5 U g-1. El mezclador se colocó a 95 °C durante 1 h. El almidón residual se estimó con la prueba de yodo (KI/I2)29.

La suspensión de almidón (1 g, 10 ml-1) se ajustó a diferentes pH (4–8). La suspensión se licuó con una enzima fijada (Termamyl® SC DS) a una proporción de sustrato (0,7 U g-1) a una temperatura fija de 95 °C durante 1 h. El almidón residual se estimó como se mencionó anteriormente.

Inicialmente, se hidrolizó 1 g.10 ml-1 de almidón con una enzima fija (Termamyl® SC DS) en relación sustrato (0,7 U g-1) y pH (6,9) a diferentes temperaturas (65–110 °C) durante 1 h6. ,30,31.

La suspensión licuada se sacarificó aún más con una proporción diferente de enzima (Fungamyl®) a sustrato (0,7–9,6 U g-1), lo que afectó el rendimiento de maltooligosacárido. Los otros tres factores (temperatura, pH y tiempo) se establecieron a 50 °C, pH 5,5 y 12 h, respectivamente. Después de 12 h, se detuvo la reacción y se usaron TLC y HPAEC-PAD para analizar la mezcla de reacción6,30,31.

El efecto de diferentes tiempos de reacción (2 a 12 h) también afectó el rendimiento de maltooligosacárido cuando los otros tres factores (relación enzima-sustrato, temperatura y pH) se fijaron en 1,2 U g-1, 50 °C y pH 5,5. , respectivamente. Todas las reacciones se detuvieron y analizaron como se mencionó anteriormente.

La suspensión licuada se sacarificó con una relación fija de enzima a sustrato (1,2 U g-1) y pH 5,5 a diferentes temperaturas (40–70 °C) durante 4 h. Después de 4 h, la reacción se detuvo y se analizó como se mencionó anteriormente.

La mezcla de reacción varió a diferentes pH (4,5–7,5), lo que afectó el rendimiento de maltooligosacárido cuando los otros tres factores (relación enzima-sustrato, temperatura y tiempo) se establecieron en 1,2 U g-1, 50 °C y 4 h, respectivamente. . Después de 4 h, la mezcla de reacción se detuvo hirviendo la mezcla durante 10 min y la mezcla de reacción se analizó como se mencionó anteriormente.

El gen de la α-transglucosidasa sintetizado se clonó en pET-28a y se transformó en E. coli BL21(DE3). La enzima se indujo con IPTG (0,2 mM) durante la noche a 18 °C en 1 litro de caldo fantástico. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación (7000 rpm, 10 min) y se lisaron mediante sonicación en tampón A (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico [HEPES] 10 mM) y las células se resuspendieron en un tampón apropiado. que tienen inhibidores de proteasa y se lisan mediante sonicación. Posteriormente, se recogió el sobrenadante, la enzima se purificó mediante una columna de purificación de ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA) y el peso molecular se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE)32.

Se utilizó la columna HisTrap HP (GE Healthcare) para purificar la proteína α-transglucosidasa. La proteína α-transglucosidasa recombinante marcada con His6 N' terminal se colocó en una columna que ya había sido preequilibrada con tampón A (HEPES 10 mM de pH 7,5, NaCl 250 mM). Se usó tampón B (HEPES 10 mM de pH 7,5, NaCl 250 mM e imidazol 500 mM) para eluir las proteínas unidas en un paso después del lavado con tampón A. Se purificó y concentró adicionalmente la proteína α-transglucosidasa con Amicon Ultra-15 de 100 kDa. concentrador de corte de peso molecular. Luego, la α-transglucosidasa purificada se mantuvo a -80 °C para su uso posterior32.

Se utilizó espectroscopia de dicroísmo circular (CD) para monitorear las alteraciones estructurales secundarias en la enzima libre después de la inmovilización. Se utilizó el equipo del espectrómetro biológico MOS-500 para registrar los espectros UV CD en la región de longitud de onda de 190 a 280 nm. Se empleó una concentración de enzima de 0,2 mg/ml en todos los experimentos de medición de CD a 6 °C en un tampón diluido (tampón de fosfato de potasio, pH 7,4). El modelo estructural terciario de α-transglucosidasa se generó en Phyre 2 y se procesó en el software PyMOL33. Se superpuso a una α-transglucosilasa (ID del banco de datos de proteínas: 4B9Z) para identificar residuos críticos34.

La suspensión sacarificada se trató adicionalmente con una proporción de 0,7 a 11 U g-1 de enzima (α-transglucosidasa) a sustrato (almidón sacarificado) en tres factores fijos: la temperatura, el pH y el tiempo fueron 45 °C, 5,5 y 12 h. respectivamente. El producto se analizó mediante TLC y detección amperométrica pulsada por cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC-PAD)1,2,3,4,5,6.

El almidón sacarificado se incubó con una proporción de 5,6 U g-1 de enzima (α-transglucosidasa) a sustrato (almidón sacarificado) a 45 °C y pH 5,5. Se extrajeron muestras en diferentes intervalos de tiempo (2 a 12 h) para optimizar el tiempo. El producto se analizó como se mencionó anteriormente.

El efecto del pH sobre el rendimiento de IMO varió entre 3,5 y 7,5 cuando la relación enzima-sustrato, la temperatura y el tiempo se establecieron en 5,6 U g-1, 45 °C durante 6 h en un baño de agua con agitación, respectivamente. Después de 6 h, se detuvo la reacción y el producto se analizó mediante TLC y HPAEC-PAD.

El almidón sacarificado se colocó a una temperatura diferente que variaba entre 35 y 75 °C y la relación enzima-sustrato, el pH y el tiempo se fijaron en 5,6 U g-1, pH 5,5 durante 6 h, respectivamente. La mezcla de reacción se analizó como se mencionó anteriormente.

Se utilizó Box-Behnken para optimizar las mejores condiciones para la reacción de transglucosilación. Los factores investigados en este estudio fueron la relación enzima-sustrato (A), el pH de la suspensión (B), la temperatura (°C) y el tiempo de reacción (h). Los tres factores se evaluaron en + 1, 0 y - 1 para niveles alto, intermedio y bajo. El diseño contiene un total de 29 ejecuciones basadas en Box-Behnken35.

Las nanopartículas magnéticas (Fe3O4) se sintetizaron mediante coprecipitación de cloruro férrico y ferroso en presencia de NaOH 1,5 M como reductor. Para preparar nanopartículas magnéticas, se disolvieron 5,4 g de FeCl3.6H2O en 25 ml de HCl 0,4 M con 2 g de FeCl2.4H2O y la mezcla de reacción se colocó a 200 °C hasta que se formó una solución transparente de color amarillo. Además, la solución transparente de color amarillo se añadió gota a gota a una solución de NaOH 1,5 M a 80 °C. A medida que se añadió la solución amarilla a la solución de NaOH, se formó una precipitación negra de Fe3O4. El precipitado se recogió en un soporte magnético y se lavó con agua MQ. El precipitado se almacenó en 200 ml de solución de hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) 0,1 M para su uso posterior24,26.

El Fe3O4 sintetizado se estabilizó mediante un recubrimiento de sílice, lo que también evitó la formación de aglomeraciones como resultado de la interacción entre partículas. La magnetita almacenada en TMAOH se colocó en un soporte magnético Falcon y se descartó el sobrenadante. La magnetita se transfirió al vaso de precipitados con una proporción en volumen de 1:1,4 de etanol y ortosilicato de tetraetilo (TEOS) al 10%. La mezcla se colocó a 90 °C durante 6 h para la síntesis de nanopartículas recubiertas de sílice, seguido de lavado y almacenamiento24,26.

Las nanopartículas de magnetita recubiertas de sílice obtenidas se unieron con un conector 16-PHDA en una proporción de 1:1. La mezcla se colocó en un ultrasonicador durante 30 min. Después de 30 min, la solución se enjuagó con agua y se guardó para uso futuro24,26.

Para acoplar la α-transglucosidasa con los grupos carboxílicos de 16-PHDA, primero se activó la mezcla usando EDC en tampón MES 0,1 M, luego se añadió α-transglucosidasa en una cantidad igual y la mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 2 h24. Se utilizó el método de Bradford para calcular la cantidad de enzima inmovilizada en nanopartículas en términos de contenido de proteína. Se utilizó la siguiente ecuación para determinar el porcentaje de carga de enzima:

Ei = Et–Es, Ei = enzima inmovilizada, Et = cantidad inicial de enzima añadida, Es = cantidad de enzima en el sobrenadante.

Se utilizó Agilent Cary, serie 660 con espectrofotómetro detector DTGS, para registrar los espectros IR de las muestras a frecuencias entre 400 y 4000 cm-1 26. Microscopía electrónica de transmisión con alta resolución (HR-TEM, LIBRA 120), 300 kV utilizada para el tamaño y la forma de Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA y Fe3O4@SiO2-16 PHDA-α-transglucosidasa. El tamaño y la morfología de la superficie de Fe3O4 y Fe3O4@SiO2 se examinaron mediante microscopía de barrido (FE-SEM, Thermoscientific Apreo S)24,26. Utilizando un difractómetro de rayos X (XRD; Rigaku, Smart LAB SE), se midieron la pureza y cristalinidad de Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA y Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-transglucosidasa26. 36. Además, el porcentaje de pérdida de peso de las muestras se analizó mediante análisis termogravimétrico (TGA) (analizador térmico simultáneo Netzsch STA 449F1) a temperaturas que oscilaban entre 25 y 800 °C en una atmósfera de nitrógeno (N2). Finalmente, el potencial zeta y la estabilidad coloidal se midieron mediante análisis de dispersión dinámica de luz (DLS)24,26.

Para determinar la estabilidad de la α-transglucosidasa libre e inmovilizada en diferentes condiciones de pH y temperatura, los maltooligosacáridos se incubaron con α-transglucosidasa a valores de pH que oscilaban entre 3,5 y 8,5 y temperaturas (30 a 80 °C), respectivamente. Finalmente, el porcentaje de actividad relativa en cada experimento representa la actividad enzimática relativa al control, que se supuso que era del 100%37,38.

La reutilización de la α-transglucosidasa inmovilizada se analizó mediante hidrólisis de maltosa, en condiciones optimizadas (relación enzima-sustrato 6,9 U g-1, tiempo de reacción 9 h, temperatura 45 °C y pH 5,5). Una vez completada la reacción, la α-transglucosidasa inmovilizada se recuperó mediante un soporte magnético al final de cada ciclo, se limpió a fondo dos o tres veces con agua desionizada y luego se usó para el ciclo posterior de la reacción. La α-transglucosidasa inmovilizada recuperada se reutilizó en la solución de maltosa nueva. Se consideró control el primer ciclo de actividad de la enzima inmovilizada, con 100% de actividad24.

Se utilizó la condición de ensayo optimizada para establecer los parámetros cinéticos de la α-transglucosidasa libre e inmovilizada, con la excepción de que la concentración de maltosa se cambió de 100 a 500 mM. Se utilizaron diagramas de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk para calcular los parámetros cinéticos, incluida la constante de Michaelis-Menten (Km), el número de rotación (Kcat) y la eficiencia catalítica (Kcat/Km)39.

Los IMO crudos se purificaron con HPLC-RI en una columna de péptido superdex 10/300 (10 x 300–310 mm). La muestra se colocó en la cabina de cromatografía a 40 °C. Se utilizó el muestreador automático para inyectar la muestra (15 µl) en la columna. La muestra se eluyó a un caudal de 0,5 ml/min con agua destilada desionizada y el efluente se recogió manualmente. Además, la muestra purificada se caracterizó por TLC, HPAEC-PAD, MALDI-TOF–MS, GC-MC y NMR40.

Se colocaron muestras de IMO (5 mg ml-1) a una distancia de 1 cm del fondo en placas de vidrio de gel de sílice TLC (60 F 254, 10 x 20 cm; gel de sílice TLC, Sigma Aldrich). Después de manchar, las muestras se dejaron secar. La parte inferior de la placa se sumergió en la fase móvil (n-propanol/agua/etanol en 70:20:10 v/v/v). Los puntos de muestra se desplazaron hacia arriba con la fase móvil. Las placas se secaron cuando la fase móvil alcanzó el segundo extremo de la placa. La solución de pulverización (5 g L-1α-naftol y 50 ml L-1 H2SO4) se aplicó sobre las placas de TLC. Las placas se calentaron a 120 °C durante 10 min18.

Se utilizó el MALDI-TOF–MS (AB SCIEX 5800) para registrar el espectro de masas de la muestra de IMO purificada. Se mezcló un volumen equivalente de solución de matriz (ácido 2,5-dihidroxibenzoico 0,1 M y 1-hidroxiisoquinolina 0,03 M en ACN acuoso al 50 por ciento) con una muestra acuosa. La mezcla de muestra se cargó en una placa objetivo MALDI y se secó41. Se generó un espectro de masas utilizando los espectros de 200 pulsos de láser42.

Para investigar la composición de enlaces glicosilo de los IMO, se produjeron derivados de acetato de alditol parcialmente metilados. Las muestras de IMO (5 mg) y 15 mg de NaOH en polvo se añadieron en DMSO seco. Cada muestra recibió 1 ml de yodometano y las mezclas se mezclaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se utilizó una corriente de nitrógeno para eliminar el exceso de yodometano y las muestras se dividieron en dos capas: superior (agua) e inferior (cloroformo). La capa inferior (cloroformo) se recuperó, se secó y se almacenó para su análisis. Luego, las muestras derivatizadas se analizaron utilizando GC-FID-MS35,42.

Los IMO purificados (10 mg) se disolvieron en 0,5 ml de D2O. Se utilizó un espectrómetro de RMN de 600 MHz para generar espectros de RMN de 1H. Cada espectro de RMN 2D se registró con técnicas de pulso estándar de Bruker. Se utilizó el estándar interno de acetona para medir los cambios químicos41,42.

Todos los experimentos se repitieron por triplicado y se analizaron mediante la prueba de Análisis de varianza (ANOVA) utilizando Graph Pad 6.0 y Prism 543. Los resultados del análisis estadístico se expresaron como media ± SEM. Las diferencias entre los valores medios de las propiedades medidas se compararon mediante la prueba de Tukey de rangos múltiples. En todos los casos, un valor de p inferior a 0,05 fue estadísticamente significativo44.

En el presente estudio, se utilizó almidón de cáscara de papa para la producción de IMO. Se aisló almidón de cáscara de papa húmeda con un rendimiento del 6,5% (± 1,1). Los IMO se produjeron mediante tres vías enzimáticas: licuefacción, sacarificación y transglucosilación. En el primer paso, la condición óptima para una licuación casi completa del almidón de papa se determinó como tiempo: 1 h, temperatura: 95 °C, pH: 6,9 y relación enzima (Termamyl®) a sustrato: 0,7 U g-1. La finalización de la licuefacción se identificó por la dispersión del color del complejo de almidón y yodo durante la reacción. Además, en el segundo paso, se utilizó Fungamyl® para la sacarificación. La condición óptima para la sacarificación completa del almidón licuado se determinó como tiempo: 4 h, temperatura: 50 °C, pH: 6–6,5 y relación enzima-sustrato: 1,2 U g-1. El análisis HPAEC-PAD del producto sacarificado mostró la presencia de maltosa (72 g l-1) y maltotriosa (18 g l-1) como constituyentes principales junto con una pequeña cantidad de glucosa (13 g l-1). La explicación detallada se proporciona en los datos complementarios (Figura complementaria S1). Se encontró que la condición optimizada de licuefacción y sacarificación era similar, como se informó en estudios anteriores6,16.

El gen (α-transglucosidasa) de A. niger se clonó en el vector pET-28a (GenScript Biotech Corporation) y se sobreexpresó adicionalmente. La α transglucosidasa purificada se analizó en SDS-PAGE, indicando un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. La imagen de visualización de SDS-PAGE (Fig. 1) recortada de la imagen original que se presenta en la Fig. S2 complementaria. En un estudio anterior, el gen que codifica la α-transglucosidasa de A. niger se clonó y expresó en Pichia pastoris para producir α-transglucosidasa45. Sin embargo, en el presente estudio fue clonado y producido por primera vez en E. coli.

Análisis SDS PAGE al 10% para la estimación del peso molecular de la α-transglucosidasa producida. (Carril 1 α-transglucosidasa purificada; carril 2 Enzima cruda (0,2 IPTG); carril 3 marcador de proteína). La imagen de visualización de la PÁGINA SDS recortada de la imagen original presentada en la figura complementaria S2.

Se estudiaron los espectros CD de la α-transglucosidasa libre e inmovilizada para analizar el impacto de la inmovilización en la estructura secundaria de la enzima. En general, no hay cambios en las estructuras secundarias de la α-transglucosidasa libre e inmovilizada (Fig. 2a), lo que sugiere que la técnica de inmovilización actual no interfiere con la estructura de la α-transglucosidasa, lo que también concuerda con el estudio anterior34.

Análisis secundario y terciario (a). Espectro CD de nanopartículas magnéticas (MNP) inmovilizadas con α-transglucosidasa y α-transglucosidasa libre; (b). El modelo estructural terciario de α-transglucosidasa se generó en Phyre 2 y se procesó en el software PyMOL. Se superpuso a una α-transglucosilasa (ID del banco de datos de proteínas: 4B9Z) para identificar residuos críticos; (C). La estructura cristalina de la α-transglucosilasa (4B9Z) sugirió que la bolsa de unión al sustrato de la α-transglucosidasa estaba formada por un surco estrecho con residuos de D371, I410, W488, H718, R644, W657 y D660.

La estructura terciaria de la α-transglucosidasa (4B9Z) sugirió que la bolsa de unión al sustrato de la α-transglucosidasa estaba formada por un surco estrecho con residuos de D371, I410, W488, H718, R644, W657 y D660 (Fig. 2b y c). En el estudio actual, es probable que D371 y D660 actúen como atacantes nucleofílicos y residuos ácido-base de la α-transglucosidasa. Estos se revelaron mediante la superposición de una estructura cristalina de α-transglucosilasa (4B9Z) en un modelo de α-transglucosilasa cuyo D412 y D480 funcionan como un atacante nucleofílico y un residuo ácido-base, respectivamente. Es probable que el Asp660 catalice el maltooligosacárido rompiendo los enlaces glicosídicos α-(1,4) y transfiriendo glucosa a maltosa o glucosa.

Para determinar la reacción de transglucosilación óptima para la producción de IMO, se investigó el efecto de cuatro variables: relación enzima-sustrato, temperatura, pH y tiempo. Los datos experimentales de un solo factor revelaron que el rendimiento más alto de IMO (58 g l-1) con glucosa y maltosa como otros componentes se representó mediante datos HPAEC-PAD (Figura complementaria S3) en condiciones óptimas, como enzima a relación sustrato: 5,6 U g-1, temperatura: 45 °C, pH: 5,5 y tiempo 6 h1,2,3,4,5,6.

Se empleó el diseño experimental Box-Behnken para estudiar las condiciones óptimas para lograr el mayor rendimiento de IMO. La relación entre las variables independiente y dependiente se puede expresar mediante el rendimiento: Y(IMOs) = 70,00–5,29A + 5,24.1B D-1,18 CD-5,76A2-2,23B2 + 0,72 C2-1,33D2. Los datos de rendimiento de las IMO se muestran en la Tabla 1. Se utilizó ANOVA para determinar la suficiencia y idoneidad de los impactos de los factores independientes en el rendimiento (Tabla complementaria S1). El modelo propuesto tuvo un valor de P bajo (0,0001), lo que muestra un modelo altamente significativo. El R2 ajustado de determinación, que fue 0,9742, también indicó que este modelo era altamente significativo. El resultado mostró que el rendimiento de los IMO se vio significativamente afectado por todos los factores independientes (A, B, C) y cuadráticos (A2, B2, C2)35. Los gráficos de superficie de respuesta en la Fig. 3 mostraron los efectos de las variables independientes y cómo interactuaban entre sí en el rendimiento de los IMO. Después de la transglucosilación, los productos se analizaron mediante HPAEC-PAD. El HPAEC-PAD estimó el rendimiento más alto de IMO en 70 g l-1 (± 2,1) en una condición desarrollada por el modelo RSM, que era una relación enzima-sustrato de 6,9 ​​U g-1, tiempo de reacción 9 h, temperatura 45 °C. y pH 5,5.

Gráficos de contorno para el efecto de parámetros variables en el rendimiento de IMO, A. Tiempo de reacción y relación enzima/sustrato, B. Temperatura y relación enzima/sustrato, C. pH y relación enzima/sustrato, D. Temperatura y tiempo de reacción, E .pH y tiempo de reacción, F.pH y temperatura.

Se utilizaron MNP para inmovilizar la α-transglucosidasa. Se coprecipitaron sales de FeCl2 y FeCl3 en solución de NaOH para producir MNP. Luego, las MNP se recubrieron con TEOS (ortosilicato de tetraetilo) al 10 %, se funcionalizaron mediante 16-PHDA y se inmovilizaron con α-transglucosidasa con alta eficiencia de unión (82 %)24.

Los datos del análisis de espectroscopía FT-IR (Fig. 4) confirmaron la formación de MNP y las modificaciones de la superficie. El grupo funcional de FeT – O – FeO se observó alrededor de 600 a 550 cm −1 en MNP. Debido al enlace Si-O-Si, se mostró un pico de estiramiento alrededor de 1031,01-1080 cm-1, lo que confirma el recubrimiento de sílice de las nanopartículas de magnetita. El pico de estiramiento fue de alrededor de 1100–900 cm −1, lo que confirma los grupos P – O y P – O – Fe después de la unión 16-PHDA. La señal espectral a 1643,32 cm-1 confirmó la presencia del grupo amida carbonilo (NH-CO) de la α-transglucosidasa inmovilizada durante la inmovilización. Los resultados del FTIR también coincidieron con el estudio publicado anteriormente24.

Espectros FTIR de α-transglucosidasa inmovilizada en MNP. (a). Fe3O4; (b). Fe3O4@SiO2; (C). Fe3O4@SiO2-16-PHDA; (d). Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-transglucosidasa.

La distribución de tamaño y las imágenes TEM de Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA y Fe3O4@SiO2-16 PHDA-α-transglucosidasa respaldan la forma casi esférica de las nanopartículas como se muestra en la Fig. 5. El diámetro previsto de las nanopartículas de Fe3O4 sin recubrir es de alrededor de 20 nm, que aumenta aún más a 35 nm después del recubrimiento de sílice, como se ilustra en la Fig. 5. Según los datos de TEM, las nanopartículas que se han modificado con un conector y una enzima tienen poco o ningún cambio en el diámetro. , lo que también concuerda con estudio previo26. Esto podría deberse a su menor densidad electrónica, ya que las moléculas orgánicas solo proporcionan una disparidad TEM inadecuada.

Imagen TEM de (a). Fe3O4, (b). Fe3O4@SiO2 (c). Fe3O4@SiO2-16-PHDA; (d). Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-transglucosidasa (barra de escala 50 nm).

La microscopía electrónica de barrido por emisión de campo investigó la morfología de la superficie y el tamaño y forma de las partículas. Los resultados mostraron en la Fig. 6a que el tamaño promedio de las partículas de Fe3O4 en forma de esfera fue de 20 a 25 nm. Además, el tamaño de la esfera de las partículas de Fe3O4 aumentó ligeramente entre 34 y 38 nm después del recubrimiento de sílice en la superficie de las partículas de Fe3O4 (Fig. 6b), comparable con un estudio anterior26,46,47. No hubo cambios significativos en la apariencia física de las nanopartículas después de la modificación con 16-PHDA y la enzima α-trasglucosidasa.

Imagen FESEM de (a); Fe3O4 (b). Fe3O4@SiO2; Imagen EDX de (c). Fe3O4 y (d). Fe3O4@SiO2.

Los resultados de la espectroscopía de rayos X de energía dispersiva (EDX) se utilizaron para caracterizar la composición porcentual en masa de las partículas sintetizadas de Fe3O4 y Fe3O4/SiO2. La Figura 6c mostró que Fe3O4 tenía una composición porcentual en masa de 64,8% Fe, 31,4% O y 3,9% C. Después del recubrimiento con sílice, la composición atómica de las nanoesferas era Fe 63,0%, O 23,6%, C 8,9% y Si 3,7%. como se muestra en la Fig. 6d. Los resultados generales coincidieron con estudios anteriores46.

Se realizó un análisis de espectroscopía de difracción de rayos X (DRX) para confirmar la pureza y cristalinidad de Fe3O4, Fe3O4@SiO2, enlazador organofosforado y nanopartículas modificadas con enzimas. La Figura 7 mostró los picos del difractograma de nanopartículas de magnetita en 2θ = 30,2°, 35,6°, 43,2°, 57,3° y 62,9° atribuidos a (220), (311), (400), (422), (511) y (440). reflexiones, lo que demuestra la cristalinidad aceptable de las nanopartículas que era comparable con datos publicados anteriormente26,36. El resultado general sugirió que las MNP no cambiaron la estructura cristalina después de la inmovilización de la enzima.

Espectros XRD de (a). Fe3O4 (b). Fe3O4@SiO2 (c). Fe3O4@SiO2-16-PHDA.

Se realizó un análisis TGA para determinar el porcentaje de pérdida de peso de Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA y Fe3O4@SiO2-16 PHDA-α-transglucosidasa (Fig. 8). Las muestras se calentaron a un rango de 25 a 800 °C para analizar el porcentaje de pérdida de peso. A temperaturas inferiores a 200 °C, todas las muestras mostraron una pérdida de masa inicial menor debido a la desorción del agua adsorbida. A medida que la temperatura aumentó por encima de 200 a 500 °C, no se observó pérdida de peso en las nanopartículas de Fe3O4. Sin embargo, se registraron pérdidas de peso de aproximadamente 3,2%, 8,8% y 12,0% en Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16-PHDA y Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-transglucosidasa respectivamente, que también estaban de acuerdo con datos publicados previamente36. La pérdida adicional de alrededor del 3,2% confirmó la unión exitosa de la α-transglucosidasa a las MNP.

Análisis termogravimétrico (TGA) de (a). Fe3O4 (b). Fe3O4@SiO2 (c). Fe3O4@SiO2-16-PHDA (d). Fe3O4@SiO2-16-PHDA unida a α-transglucosidasa.

Se utilizó el potencial zeta para evaluar cómo la carga superficial de la enzima y las MNP en la solución afectaban la estabilidad de sus partículas coloidales. La estabilidad de la solución coloidal aumentaría al aumentar el potencial zeta. Los resultados de medir el potencial zeta de Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16-PHDA y Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-transglucosidasa se muestran en la Tabla 2. El potencial zeta de Fe3O4@SiO2-16- La PHDA aumentó a niveles positivos (de −46,0 a −31,0) después de la inmovilización de la α-transglucosidasa, lo que indica que una α-transglucosidasa menos negativa neutralizó las MNP cargadas negativamente, lo que también concuerda con el estudio anterior24. Además, los valores de PDI de todas las MNP en el rango de 0,161 a 0,212 sugirieron una mayor estabilidad coloidal.

Las actividades de α-transglucosidasa libre e inmovilizada se midieron en un rango de temperatura y pH de 30 a 80 °C y 3,5 a 8,5, respectivamente. Los resultados revelaron que la temperatura óptima para la α-transglucosidasa libre era de 45 °C, que se empujó ligeramente hacia los 55 °C para la α-transglucosidasa inmovilizada (Fig. 9a). Además, se produjo una reducción significativa (30 % a 80 °C) en la actividad de la α-transglucosidasa libre, mientras que la enzima inmovilizada retuvo casi el 70 % de la actividad a 80 °C. La Figura 9b reveló que la α-transglucosidasa libre e inmovilizada exhibió una actividad casi similar a un pH óptimo de 5,5. Sin embargo, se observó una mayor retención de la actividad para la α-transglucosidasa inmovilizada en comparación con la enzima libre a pH 8,5. El resultado general también estuvo de acuerdo con estudios previos que sugerían que la inmovilización de nanopartículas magnéticas mejoraba la estabilidad térmica y del pH37.

Estabilidad de la α-transglucosidasa libre e inmovilizada (a). a diferentes rangos de temperatura de 30 a 80 °C y (b). Rango de pH de 3,5 a 8,5. (C). Reutilizabilidad de la α-transglucosidasa inmovilizada en 10 ciclos de reacción posteriores realizados en condiciones optimizadas (6,9 U g-1, 45 °C, 9 h y pH 5,5). La actividad enzimática del primer ciclo se considera del 100%. Todos los datos se representan como media ± DE (n = 3).

La ventaja de las MNP es su fácil eliminación de una mezcla de reacción mediante el uso de un imán simple que proporciona nanopartículas magnéticas candidatas independientes a otras nanopartículas no magnéticas. El resultado mostrado en la Fig. 9c demostró claramente que la α-transglucosidasa inmovilizada retuvo su actividad hasta más del 60% después de 5 ciclos de reacción. Además, se observó que el rendimiento máximo de IMO (64 g l-1 ± 2,3) se logró con α-transglucosidasa inmovilizada en las condiciones óptimas como relación enzima-sustrato 6,9 U g-1, tiempo de reacción 9 h, temperatura de reacción 45 °C y pH 5,524.

El análisis de los parámetros cinéticos enzimáticos de la α-transglucosidasa libre e inmovilizada, como la constante de Michaelis-Menten (Km), el número de recambio (Kcat) y la eficiencia catalítica (Kcat/Km), se evaluó utilizando un software GraphPad Prism versión 543. Los parámetros enzimáticos se calcularon utilizando diagramas de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk. La figura S4 ilustra los resultados del estudio cinético de la α-transglucosidasa en diferentes concentraciones de maltosa. El resultado mostró hasta 300 mM de maltosa, la velocidad de reacción y la concentración de maltosa están correlacionadas linealmente. La velocidad de reacción se estabilizó cuando la concentración de maltosa era superior a 300 mM. Los resultados que se muestran en la Tabla 3 respaldan los hallazgos de la Fig. S4 en sus observaciones. Los valores de Km de las enzimas libres e inmovilizadas fueron 97,85 ± 11,40 y 81,08 ± 9,990, respectivamente. El valor de mejor ajuste de Kcat es 1107 ± 14,28 y 715,6 ± 9,528 para enzimas libres e inmovilizadas39.

Se utilizaron TLC y HPLC para analizar los productos de la reacción de transglucosilación (Fig. S5). A medida que el tiempo de hidrólisis aumentó del carril 1 (6 h) al carril 5 (30 h), la concentración de glucosa aumentó y la concentración de oligosacáridos disminuyó, como se muestra en la Fig. S5a. Esto se debe al hecho de que los oligosacáridos se degradan en glucosa a medida que pasa el tiempo, lo que hace que la banda de glucosa se oscurezca con el tiempo y la banda de oligosacárido desaparezca. La figura S5b mostró el cromatograma HPAEC-PAD de los productos de la reacción de transglucosilación después de un tiempo de hidrólisis de 6 h.

El producto obtenido después de la transglucosilación del almidón sacarificado se separó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Además, el análisis HPAEC-PAD reveló que el contenido de glucosa en la fracción rica en IMO purificada se redujo a 4 g l-1 (datos complementarios, figura S6). Los demás constituyentes de las fracciones purificadas debían ser como; isomaltosa: 37,7 g l-1, isomaltriosa: 21,6 g l-1, panosa: 17 g l-1, maltosa: 3 g l-1, y otro oligosacárido: 20 g l-1. La pureza de la fracción rica en IMO fue de casi el 85 %, lo que era casi similar a lo descrito en el estudio anterior48.

Se utilizó MALDI-TOF–MS para analizar los IMO purificados. El análisis mostró la presencia de oligosacáridos DP 2–10 (m/z 365–1337 Da) mostrados en la Fig. 10, comparables a los datos publicados anteriormente49. Sin embargo, según el análisis de picos m/z, la cantidad de oligosacáridos DP > 10 era muy baja e indetectable.

Espectroscopia MALDI-TOF-MS de los IMO formados generados después del tratamiento de almidón sacarificado con α-transglucosidasa.

El análisis de enlace glicosilo de los IMO indica que los residuos de Glcp unidos a glucopiranosilo terminal (Glcp), α-(1 → 4) y α-(1 → 6) D fueron más abundantes en una relación molar de casi 1,02:0,43:1,0 con el pequeña cantidad de residuos de Glcp unidos a α-(1 → 2) y α-(1 → 3) en una relación molar relativa de casi 0,12 y 0,05. Los datos del análisis de vinculación se muestran en la Tabla 4, y se proporcionan cifras detalladas en los datos complementarios (Figura complementaria S7). El estudio indicó además que los IMO contienen residuos de Glcp unidos a α-(1 → 4) y α-(1 → 6) como enlace principal presente en isomaltosa, isomaltriosa y panosa, lo cual fue comparable con el estudio informado anteriormente50.

Los IMO purificados en cuya fracción se caracterizaron mediante espectroscopia de RMN de RMN 1H, 13C y 2D (TOCSY y HSQC) (Figura complementaria S8).

La espectroscopía de RMN 1H mostró la señal anomérica en δ 5,225 (α) y δ 4,649 (β) en disposición con una unidad reductora de α-(1 → 4) D Glcp. Además, los grupos de señales anoméricas a lo largo de δ 5.389–5.395 y 4.970 revelaron la presencia de enlaces α-(1 → 4) y α-(1 → 6), respectivamente. Se encontró que la relación de enlace α-(1 → 6): α-(1 → 4) era de aproximadamente 1,0:0,67, lo que sugirió la presencia de enlaces α-(1 → 6) significativamente mayores. El resultado también estuvo de acuerdo con la relación de enlace α-(1 → 6): α-(1 → 4) obtenida mediante análisis de enlace glicosilo.

El desplazamiento químico del 13C se dedujo de las mediciones de 13C y HSQC. El análisis reveló la presencia de señales anoméricas de enlace α-(1 → 4) y α-(1 → 6) en el rango de δc 100,7 y 98,3, respectivamente. Las señales anoméricas de δc 92.6 y 96.6 fueron indicativas de la reducción de los residuos α-(1 → 4) D-Glcp y β-(1 → 4), respectivamente. Las señales anoméricas coincidieron con los resultados informados anteriormente11. La señal anomérica de δH/δC en 5.427/90.2 y 4.785/97.1 sugirió la presencia de residuos reductores de α-(1 → 2) D-Glcp y β-(1 → 2) D-Glcp. Además, la señal anomérica en δH/δC en 5.233/93,2 y 4.663/96,8 fue indicativa de reducción de los residuos α-(1 → 3) D-Glcp y β-(1 → 3). El análisis detallado de RMN se resume en la Tabla 5.

Los IMO se han producido a partir del almidón de cáscara de patata mediante licuefacción, sacarificación y transglucosilación en tres pasos. En E. coli se ha producido una α-transglucosidasa recombinante de A. Niger. La α-transglucosidasa se inmovilizó con MNP para su reutilización (5 ciclos con más del 60 % de actividad) y se caracterizó mediante análisis FT-IR, TEM, FESEM, EDX, XRD, TGA y DLS. El rendimiento máximo de IMO (70 g l-1) se logró con RSM. La caracterización estructural detallada de los IMO sugirió DP en rangos de 2 a 10 con la presencia de residuos α- (1 → 4) y α- (1 → 6) -D-Glcp como constituyentes principales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores expresan su agradecimiento al Director Ejecutivo de NABI por su aliento y asistencia. Los autores agradecen al Instituto Nacional de Biotecnología Agroalimentaria (NABI) y a la Comisión de Becas Universitarias (UGC) su asistencia financiera. Por los experimentos de RMN, los autores agradecen al centro de investigación de RMN IISER Mohali. Agradecemos al Dr. Kanti Kiran Kondepudi por su ayuda en el trabajo de investigación y la asistencia técnica de Atul Kesarwani. También agradecemos a Raminder Kaur por su asistencia técnica en la grabación de espectros de CD.

Instituto Nacional de Biotecnología Agroalimentaria (NABI), Sector-81 (Ciudad del Conocimiento), SAS Nagar, Mohali, Punjab, 140306, India

Rohit Maurya, Usman Ali, Sunaina Kaul, Ravindra Pal Singh y Koushik Mazumder

Centro Regional de Biotecnología, Faridabad-Gurgaon, Haryana, 121001, India

Rohit Maurya

Departamento de Biotecnología Industrial, Universidad de Biotecnología de Gujarat, North Gate Gujarat International Finance Tech-City, Gandhinagar, Gujarat, 382355, India

Raja Bhaiyya y Ravindra Pal Singh

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Contribuciones de los autores Rohit Maurya contribuyó (Extracción de almidón; Producción, purificación, inmovilización y caracterización de enzimas; Producción de IMO, optimización, purificación y caracterización de RSM): investigación; metodología; análisis formal; redacción del borrador original. Usman Ali contribuyó (optimización RSM de IMO): investigación; metodología; análisis formal. Sunaina Kaul contribuyó (inmovilización enzimática): investigación; metodología; análisis formal. Raja Bhaiyya contribuyó (producción de enzimas): investigación; metodología; análisis formal. Ravindra Pal Singh: supervisión; metodología; redacción-revisión y edición. Koushik Mazumder: conceptualización; supervisión; administración de proyecto; metodología; borrador original escrito; redacción-revisión y edición.

Correspondencia a Koushik Mazumder.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Maurya, R., Ali, U., Kaul, S. et al. Inmovilización de α-transglucosidasa sobre nanopartículas magnéticas recubiertas de sílice y su aplicación para la producción de isomaltooligosacárido a partir de la cáscara de papa. Representante científico 13, 12708 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38266-8

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Recibido: 02 de mayo de 2023

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 05 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38266-8

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